免疫荧光实验

撒云俐实验笔记

• 1：6孔板种细胞并转染 ( cell/孔）
  例如HCT116细胞系:
  
  
  
• 2：36h后，将细胞种到12孔板中，(种细胞前，用灭过菌的镊子将细胞怕片放到12孔板中，种 cell/孔)
• 3：待细胞完全贴壁值 70%~80% 后，加药处理24h
• 4：24h后，沿培养基12孔板壁加 PBS(预先恢复至室温)，清洗3遍
• 5：弃1 PBS，加 4% 多聚甲醛，室温静置固定20分钟，1 PBS 洗2次（5分钟/次）
• 6：加0.5% TritonX-100，1ml/孔，室温静置20分钟。1PBS洗3次，3分钟/次
• 7：封闭：去除玻片，正面朝上放到另一新的12孔板中，每孔加800L 3%BSA封闭1h
• 8：孵一抗：吸去封闭液，每片滴加足量稀释的一抗（用0.1%BSA配置），加盖湿盒， 过夜孵育（一抗稀释比详见说明书）
• 9：吸去一抗，每孔加1mL PBS清洗，放在水平摇床上清洗，5分钟/次（共3次），孵二抗（二抗用之前离心，不要将沉淀吸出），室温避光孵育1小时（1：400）荧光二抗，用0.1%BSA配置，PBST清洗3次（3分钟/次）
• 10（复染核）：滴加DAPI（1mg/ml）避光孵育5分钟后，PBST洗4次，5min/次
• 11：（封片拍照）：将玻片正面向下倒扣在载玻片上，四周用指甲油固定，待干涸后，可现在普通荧光显微镜下观察是否有荧光，再用激光共聚焦显微镜观察